逍遥右脑 2013-03-30 18:00
辅导教案
基础链接•温故知新
一、细胞的增殖
1．细胞周期：从上一次分裂________到下一次分裂________所经历的整个过程，叫细胞周期。它包括________(简称)和________间期。
如右图，_______是一个细胞周期。
2．有丝分裂的意义在于亲代细胞的染色体经过________后，精确地平均分配到两个________中去，保证了遗传性状的________。
二、细胞的分化与癌变
1．细胞的后代在形态、结构和功能上发生________的过程叫细胞的分化。
2．癌细胞是由正常细胞发生________而的癌变的细胞，它的重要特点是________和________。
三、特异性免疫
B淋巴细胞受抗原刺激后可分化为效应B淋巴细胞和________，前者能产生大量的________参与体液免疫。
一、1.结束 结束 分裂期 分裂 bc 2. 复制 子细胞 稳定性
二、1.稳定性 2.突变 无限增殖 易于转移
三、记忆细胞 抗体
聚焦科技•扫描知识
动物克隆技术的基础是动物的细胞和组织培养，细胞培养主要是体外人工培养方法进行实验。细胞全能性的揭示、细胞周期调节控制机理的分析、癌变机理和衰老原因的研究，都与细胞培养技术密不可分。
一、动物细胞的培养和克隆形成
1．动物细胞、组织培养
细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就停止分裂增殖。
(1)动物细胞培养的方法
进行动物细胞培养时，首先将组织块剪碎，用机械法或胰酶处理，使其分散成许多单个细胞，然后，在人工控制的条下，使这些细胞生存和生长、分裂乃至接触抑制和有规律的衰老、死亡等生命活动现象。
由于细胞培养中，细胞之间并非彼此独立而是在生命活动中相互依存，所以在某种程度上像体内一样呈现一定的组织特性。
(2)动物组织培养的含义
胰酶能使细胞分散开的原因是可分解细胞间的胶原蛋白，使细胞间的联系性减小。
动物组织在体外及人工条下维持生活状态或生长特性。
(3)动物细胞、组织培养的关系
①二者在离体情况下，都能培养并表现正常的生命活动；
②不同点是，动物组织培养在得到离体组织后，需要机械处理或胰蛋白酶处理得到分散的细胞再进行细胞培养，同时动物组织培养过程中可以伴随组织分化。
2．动物组织培养技术的发展
(1)发展简史及近况
①萌芽时期在19世纪，1885年，鸡神经板在生理盐水中培养成活。
②1903年，皮肤及白细胞培养在腹水及血清中细胞存活时间长达1个月。
③1907年真正的组织培养开始，并在蛙胚神经管培养中看到了神经纤维末端的阿米巴运动。
(2)动物组织培养的流程
取动物组织块→剪碎组织→用胰蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养液中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，制成细胞悬液→转入培养液中进行传代培养→放入二氧化碳培养箱中培养。
转化即正常细胞在某种因子的作用下发生突变而形成具有癌性的细胞。
①原代培养：从机体取出后立即进行的细胞、组织培养。
原代培养的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后(一般10代以内)停止生长，需要重新更换培养基。
②传代培养：将原代培养的细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶，叫传代培养。
有时也把最初的若干次传代培养归入原代培养范围。
正常细胞培养时，细胞传到一定代数便会衰老、死亡，不能无限制地传下去，但有些突变和转化的细胞却无限传代。如HeLa细胞系就是1951年从一位黑人宫颈癌患者的癌细胞培养至今而形成的肿瘤细胞系。
3．细胞系、细胞株
(1)细胞系：可连续传代的细胞。
①特点：无限增殖。
②类型
a．连续细胞系：能连续培养下去的细胞系。是发生转化了的细胞系，大多数具有异倍体核型，有的是恶性细胞系，具有异体致癌性，有的连续细胞系获得了不死性，但保留接触抑制现象，不致癌。
b．有限细胞系：不能连续培养下去的细胞系。二倍体细胞一般为有限细胞系。
细胞系泛指可传代的细胞，细胞株是具有特殊性质的细胞系。
(2)细胞株：从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞，能够繁殖50代左右。
①特点：能始终保持特征。
②类型
a．连续细胞株：可连续多次传代的细胞株。
b．有限细胞株：可传代次数有限的细胞株。
4．克隆培养法
克隆培养法可以得到纯系的细胞系。
(1)克隆：亦称无性繁殖系或简称无性系。对细胞说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。
(2)克隆培养法(细胞克隆)：把一个单细胞从群体中分离出单独培养，使之繁衍成一个新的细胞群体的技术。
(3)克隆的基本要求：必须保证分离出的细胞是一个而不是多个，即必须肯定所建成的克隆于单个细胞。
(4)用于克隆的细胞：理论上所有的细胞都可以克隆，但原代培养细胞和有限系克隆起有困难。只有对培养环境有较大适应范围和具有较强独立生存能力的细胞，才容易做细胞克隆。
无限细胞系、转化细胞系和肿瘤细胞等比较容易克隆。
(5)提高细胞克隆形成率的措施
①选择适宜的培养基；
②添加血清；
③以滋养细胞支持生长；
④激素(胰岛素等)刺激；
⑤使用CO2培养箱调节pH和选择细胞生长支持物。
(6)应用：最主要用途之一就是从中分离出缺乏特殊基因的突变细胞系。
二、动物的细胞融合技术及其应用
1．细胞融合与细胞杂交
(1)细胞融合
细胞融合
①概念：两个或多个细胞结合成一个细胞的现象。
②过程：动物细胞的融合与植物原生质体的融合的原理基本相同。诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的仙台病毒、电刺激等。但植物原生质体的融合不用灭活的仙台病毒。
(2)细胞杂交
细胞融合的原理是细胞膜的流动性。
①概念：基因型不同的细胞间的融合。
②特征：杂交细胞中的染色体容易丢失。
(3)二者关系：细胞融合包含体细胞杂交，细胞融合可以在基因型相同或不同的细胞间进行，而基因型不同的细胞间的融合就是细胞杂交。
融合(杂交)形成的杂种细胞包含两个亲本的遗传物质，其染色体数、基因组成情况、染色体组都是两个细胞之和。
(4)意义：克服了远缘杂交的不亲和性，成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。
2．杂交瘤技术和单克隆抗体制备
利用细胞杂交技术，将抗体生成细胞(B淋巴细胞)与瘤细胞杂交，形成一杂种细胞(杂交瘤技术)的过程。
(1)抗体：B淋巴细胞产生。主要成分：球蛋白，具有特异性，从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。
(2)杂交瘤细胞的特点：既能大量无限繁殖，又能产生专一抗体。
(3)制备基本过程
①用外界抗原刺激动物，使其发生免疫反应，得到B淋巴细胞。
②用聚乙二醇、灭活的仙台病毒作介导，使免疫的脾细胞与骨髓瘤细胞融合。(获得三种融合细胞：B—B细胞、B—瘤细胞、瘤—瘤细胞)
③然后筛选获得杂交瘤细胞。
在选定的培养基上，未融合的细胞和融合的同种核的细胞会死亡，只有融合的细胞才能生长，并产生特异性抗体。
杂交瘤技术制备抗体的最大优点是：可以从特定抗原成分比例极少的抗原混合物中获得单抗。
(4)单克隆抗体的优点：专一性强，灵敏度高，并可大量制备。
三、动物的克隆繁殖
1．动物细胞全能性的表现程度
(1)受精卵具有全能性
动物完整的个体就是由受精卵发育的，所以受精卵具有全能性；受精卵的卵裂期，细胞没有分化，也具有全能性。
骨髓干细胞分化示意图
(2)分化细胞的全能性受限制
胚胎细胞发育到一定阶段，细胞不具有发育成完整个体的潜能，只具有分化出多种组织细胞的潜能，这样的细胞叫多能干细胞，如多能造血干细胞，可分化为红细胞、白细胞和血小板等。有的只能分化为一种细胞，如单能造血干细胞。有的已经分化了的细胞不再分化为其他细胞，甚至终生不再分裂，如高度分化的神经细胞。
(3)不同生物的全能性及逆分化
低等动物细胞的全能性一般比较容易体现，如水螅。分化的细胞也可逆转为正常细胞，如癌细胞。
(4)干细胞按能力可以分为以下四类：
①全能干细胞：由卵和精细胞的融合产生受精卵。而受精卵在形成胚胎过程中四细胞期之前任一细胞皆是全能干细胞。具有发展成独立个体的能力。也就是说能发展成一个个体的细胞就称为全能干细胞。
②万能干细胞：是全能干细胞的后裔，无法发育成一个个体，但具有可以发育成多种组织的能力的细胞。
③多能干细胞：只能分化成特定组织或器官等特定族群的细胞(例如血细胞，包括红血细胞、白血细胞和血小板)。
④专一性干细胞：只能产生一种细胞类型；但是，具有自更新属性，将其与非干细胞区分开。
2．动物难以克隆的根本原因
理论上讲，特化的动物细胞基因组是完整的，具有全能性。
核移植的原理是细胞核的全能性。
实际上，细胞在分化过程中，基因表达的调控使得细胞中合成了专一的蛋白质，即细胞基因组中的基因不同时进行活动，或发生差异性表达，因此，不能像受精卵一样发挥细胞的全能性。
即动物难以克隆的根本原因是基因的选择性表达。
动物细胞的全能性会随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能逐渐变弱。目前还不能用类似于植物组织培养的方法获得完整的动物个体，用动物细胞克隆的动物，实际上是通过核移植实现的。
3．细胞核移植实验和动物的克隆繁殖
(1)核移植：利用一个细胞的细胞核(供体核)取代另一个细胞中的细胞核，形成一个重建的“合子”的过程。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。
(2)过程(以蛙形成为例)：
用囊胚细胞(或皮肤细胞)核移植到去核的卵母细胞中，重组细胞发育成了蝌蚪，有的甚至变态发育为成蛙。
受体细胞一般选用卵母细胞，是因为其体积大，易操作；细胞内含有促使细胞核表达全能性的某种物质和营养条。
(3)首例体细胞克隆动物(克隆羊)
多莉的性状与供核母羊(白面绵羊)相似但不完全相同。
通过体细胞克隆动物的成功，证明了：①高度分化细胞经过一定技术处理，也可回复到类似受精卵时期的功能；②在胚胎和个体发育中，细胞质具有调控细胞核(包括异的细胞核)发育的作用。
(4)克隆的生物学机理
①重组卵细胞最初分裂时虽然复制了DNA，但基因的转录并未开始；
②供体核DNA开始丢失于乳腺细胞的调节蛋白，阻止了核基因的表达；
③重组卵细胞开始第三次分裂时，原乳腺细胞的调节蛋白便全部被卵细胞质中的蛋白因子替换了，核DNA被重排，胚细胞开始表达自己的基因，进而调控在代孕母体子宫中的进一步发育。
(5)意义
①为遗传疾病的治疗、优良品种的培育等提供重要途径；
②利于对物种的优化、濒危动物的保存和对转基因动物的扩群；
③丰富人们的物质生活(制备血精蛋白等)，降低畜牧业成本，缩短育种年限，提高生产效率等。
纲举目张•理清结构
动物克隆技术的基础是动物细胞培养和组织培养。动物细胞培养可以获得需要的细胞株系。动物细胞工程的主要技术手段是细胞培养和细胞融合，通过其发展起的单克隆抗体技术带了细胞免疫学中的一次革命。由于动物个体发育过程中基因的选择性表达，使得动物难以通过克隆进行繁殖，胚胎细胞克隆技术和体细胞核移植技术已经成功实现了部分动物的克隆繁殖。
突破难点•化解疑点
1．辨析比较植物组织培养和动物细胞培养。
探究发现：
比较项目原理培养基结果培养目的
植物组织培养细胞的全能性固体；营养物质，激素培育成植株快速繁殖
动物细胞培养细胞的增殖液体；营养物质，动物血清等培育成细胞系或细胞株获得细胞的产物或细胞
我的发现
2．为什么不用两个而要用多个细胞进行动物细胞间的融合？
探究发现：就目前常用的细胞融合方法看，不管是用物理的、化学的方法，还是生物的方法，其融合率都不可能达100%。仅用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。更重要的是，即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的细胞类型。目前动物细胞融合技术最有价值的应用就是单克隆抗体的制备。我们以制备单克隆抗体为例说明这一问题。我们知道，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，但是每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，如果仅取一个脾细胞(含B淋巴细胞)和一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合，就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
我的发现
3．如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？
探究发现：融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体(常用酶联免疫吸附实验法)，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。
我的发现
4．列表比较动物细胞融合与植物体细胞杂交。
探究发现：
比较项目细胞融合的原理细胞融合的方法诱导手段用法
植物体细胞杂交细胞膜的流动性去除细胞壁后诱导原生质体融合离心、电刺激、振动、聚乙二醇等试剂诱导克服了远缘杂交的不亲和性，获得杂种植株
动物细胞融合细胞膜的流动性使细胞分散后诱导细胞融合除上述手段外，再加灭活的病毒诱导制备单克隆抗体的技术之一
我的发现